Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии



Скачать 250.04 Kb.
Дата25.07.2014
Размер250.04 Kb.
ТипРабочая программа
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное бюджетное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«Сыктывкарский государственный университет»

Институт естественных наук

Кафедра биологии

УТВЕРЖДЕНО

На заседании учебно-

методической комиссии института

«_______»__________________2011 г.
Протокол №_________
Председатель УМК

____________________________


Рабочая программа

Дисциплина: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОЛОГИИ

Блок дисциплин: Б.2.В.5

Направление 020400.62 Биология

Квалификация выпускника –Бакалавр

Форма обучения дневная

Семестр - 6

Всего учебных занятий – 144 часов

В том числе:

Аудиторных – 54 часа, из них

Лекций – 24 часа

Лабораторных занятий – 30 часов

КСР – 8 часов

ЗЕТ – 4 часа

Самостоятельных – 48 часов

Форма итогового контроля - зачет

Сыктывкар 2011


МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное бюджетное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«Сыктывкарский государственный университет»

Институт естественных наук

Кафедра биологии
УЧЕБНО_МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС

Дисциплина: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОЛОГИИ

Блок дисциплин: Б.2.В.5

Направление 020400.16 Биология

Квалификация выпускника –бакалавр

Форма обучения дневная

Сыктывкар 2011



ЛИСТ СОГЛАСОВАНИЯ И УТВЕРЖДЕНИЯ РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЫ

Составитель УМК

доцент каф. биологии, к.б.н._____________________А.А. Мищенко

Рабочая программа составлена на основании ФГОС и учебного плана аннотированной бакалаврской программы по специальности 020400.62 биология

Рабочая программа рассмотрена и одобрена на заседании кафедры биологии

Протокол заседания № ______ от «______»_________________2011 г.

Заведующий кафедрой

профессор ___________________________Г.Н. Доровских

СОГЛАСОВАНО:

Директор института естественных наук

доцент __________________________И.Н. Юранева

«______»____________________2011 г.

Председатель УМК института естественных наук

доцент ______________________ И.Н. Юранева

1. Цели освоения дисциплины

Ознакомление с современными методами биологических исследований, знакомство с методами лабораторных исследований в мед.

учреждениях, приобретение практических навыков при освоении распространенных методов лабораторных исследований.



2. Задачи курса:

В результате освоения дисциплины студент должен:



  • знать основные иммунологические методы лабораторных исследований

  • владеть широким спектром цитологических, молекулярно-биологических, биотехнологических методов;

  • уметь объяснять принципы использования методов, лежащие в их основе законы, пояснять их построением моделей и уравнениями.

3.Место дисциплины в профессиональной подготовке выпускника. Компетенции обучающегося, формируемые в результате освоения дисциплины.

Место в учебном плане: Б.2.В.5

В процессе освоения дисциплины должны быть сформированы следующие общие и профессиональные компетенции:

ОК-1- следует этическим и правовым нормам в отношении других людей и в отношении природы (принципы биоэтики), имеет четкую ценностную ориентацию на сохранение природы и охрану прав и здоровья человека

ОК-3 - приобретает новые знания и формирует суждения по научным, социальным и другим проблемам, используя современные образовательные и информационные технологии;

ОК-6 - использует в познавательной и профессиональной деятельности базовые знания в области математики и естественных наук, применяет методы математического анализа и моделирования, теоретического и экспериментального исследования;

ОК-8 - проявляет экологическую грамотность и использует базовые знания в области биологии в жизненных ситуациях; понимает социальную значимость и умеет прогнозировать последствия своей профессиональной деятельности, готов нести ответственность за свои решения;

ПК-3 - демонстрирует знание принципов структурной и функциональной организации биологических объектов и механизмов гомеостатической регуляции; применяет основные физиологические методы анализа и оценки состояния живых систем ();

ПК-5 - применяет современные экспериментальные методы работы с биологическими объектами в полевых и лабораторных условиях, навыки работы с современной аппаратурой

ПК-17 - понимает, излагает и критически анализирует получаемую информацию и представляет результаты полевых и лабораторных биологических исследований;

ПК-19 - пользуется современными методами обработки, анализа и синтеза полевой и лабораторной биологической информации, демонстрирует знание принципов составления научно-технических проектов и отчетов.
4. Формой итогового контроля является зачет – семестр 6

Для получения допуска к экзамену требуется посещение не менее 90% занятий, сдача всех лабораторных работ


КАЛЕНДАРНО - ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН



Наименование разделов, тем

Количество часов по учебному плану




Максимальная нагрузка студентов

Аудиторная нагрузка

Самостоятельная работа

Всего

В том числе

Лекции

Лабор работа

1

Раздел 1. Имунологические методы исследований

Тема 1. Иммунодиффузия; иммуноэлектрофорез

Тема 2. Метод локального гемолиза в геле. Агглютинация. Выявление антител.

Тема 3. Титрование комплемента. Реакция лимфоцитолиза.

Тема 4. Выявление субпопуляций лейкоцитов. Выделение иммуноглобулинов.





6
6
6


6

2
2
2


2

4
4
4


4


16

2

Раздел 2. Основные методы диагностических исследований, используемых в медицине

Тема 1. Принципы электрокардиографии.

Тема.2. Электроэнцефалография.

Тема 3. Механические колебания и волны. УЗИ.

Тема 4. Элетричество и магнетизм. Томография.





6

6



6
2

2

2



2
2


4

4



4

16

3

Раздел 3. Биофизические методы исследований и методы молекулярной биологии

Тема 1. Интерференция и дифракция света. Рентгеноструктурный анализ.

Тема 2. Основные законы люминесценции. Использование в исследованиях.

Тема 3. Методы молекулярной биологии.





2
2
6


2
2
4


2


16



КАРТА ОБЕСПЕЧЕННОСТИ УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКОЙ

ЛИТЕРАТУРОЙ

Число студентов

Список литературы

Кол-во экз.

Кол-во экз на 1 студ.




Иммунологические методы под ред. Х. Фримеля. М.:Мир. 1979.519 с.

Федорова В.Н., Степанова Л.А. Краткий курс медицинской и биологической физики с элементами реабитологии. М.:Физматлит. 2008. 623 с.

Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия в 3-х т. М.:Мир. 1985.

Методы исследований в иммунологии под ред. Лефковитса И. и Перниса Б. М.:Мир. 1981. 486 с.

Фундаментальная и клиническая физиология под ред. Камкина А. и Каменского А. М.:Академия. 1073 с.









Составитель, преподаватель__________________Мищенко А.А.

Зав. кафедрой _________________________Доровских Г.Н.

Дата составления карты «_______»________________2011 г.

СОГЛАСОВАНО:

Директор библиотеки СыктГУ________________

«_______»____________________2011 г.

Содержание



Название

Стр.

Содержание учебной дисциплины………………………………………………………………………………..

Лабораторные занятия……………………………………………………………………………………………………







СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Содержание курса построено на основе исследования биологических систем разного уровня организации – от молекулярного до клеточного и организменного. Методы, с которыми предполагается знакомство студентов, также классифицированы по данному принципу. В ознакомительном порядке рассматриваются методы молекулярной и клеточной биологии, в особенности рентгеноструктурного анализа, ядерно-магнитного резонанса, электронной парамагнитной резонансной спектроскопии, патч – клампа, полимеразной цепной реакции и генетического «нокаута». Среди методов, позволяющих исследовать клетку в целом, помимо прочих рассмотрены спектроскопические методы, форез клеток, методы иммунологических исследований и лабораторного анализа. Большое внимание уделено основным медицинским диагностическим методам исследований, основанным на анализе акустических, механических, электрических колебаний и волн, взаимодействия электромагнитного излучения с тканями и органами (начиная от классической электрокардиографии и электроэнцефалографии до таких сравнительно новых методов, как магнито-резонансная томография, эхокардиография, допплеркардиография). Отдельная часть курса посвящена электробезопасности, надежности медицинской электронной аппаратуры и использованию в медицинских целях инфракрасного, ультрафиолетового, рентгеновского и прочих типов излучений.

На практических занятиях студенты освоят ряд классических методов исследований биомолекул и клеток и ознакомятся с некоторыми медицинскими методами лабораторных обследований пациентов.

Раздел 1. Имунологические методы исследований

Тема 1. Иммунодиффузия; иммуноэлектрофорез

Уравнения, описывающие законы диффузии и электрофореза. Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони. Принцип метода. Реагенты и проведение иммунодиффузии. Оценка результатов. Модификации двойной радиальной иммунодиффузии. Определение титиров антигенов и антител.

Простая линейная иммунодиффузия по Удену: реагенты, проведение исследования, построение калибровочной кривой, оценка метода.

Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини. Принцип, проведение исследования,калибровочная кривая, оценка метода.

Иммуноэлектрофорез. Принцип метода, проведение исследований. Варианты имуноэлектрофоретического анализа: методы Оссермана и Гереманса. Оценка метода.

Количественный двумерный иммуноэлектрофорез (перкрестный электрофорез по Лореллу). Принцип, этапы, идентификация преципитата. Электроиммунный анализ по Лореллу. Определение иммуноглобулинов.

Тема 2. Метод локального гемолиза в геле. Агглютинация. Выявление антител.

Принцип метода. Проведение исследований. Непрямой метод локального гемолиза. Индикаторные эритроциты. Оценка метода. Принцип метода гемагглютинации. Проведение исследований и оценка метода. Титрование антител к антигенам E. coli в реакции гемагглютинации. Выявление австралийского антигена методом латекс – агглютинации. Реакция агглютинации лейкоцитов. Выделение лейкоцитов. Оценка метода. Выявление агглютинирующих антилейкоцитарных и антитромбоцитарных антител.

Тема 3. Титрование комплемента. Реакция лимфоцитолиза.

Принцип метода. Проведение исследований. Титрование гемолизина, сенсибилизация эритроцитов, титрование комплемента. Рассчеты. Оценка метода. Реакция связывания комплемента. Принцип метода, его проведение, оценка. Выявление антитромбоцитарных антител в реакции связывания комплемента. Реакция лимфоцитолиза. Проведение и оценка метода.

Тема 4. Выявление субпопуляций лейкоцитов. Выделение иммуноглобулинов.

Выделение гранулоцитов человека. Методика, принцип. Выделение в градиенте плотности. Оценка метода. Выделение лимфоцитов. Методики. Выделение с помощью додеронового фильтра. Выделение в градиенте плотности. Оценка методов. Приготовление лейкоцитарных суспензий. Удаление эритроцитов из суспензии иммунокомпетентных клеток. Выделение и идентификация различных субпопуляций лимфоцитов.

Раздел 2. Основные методы диагностических исследований, используемых в медицине

Тема 1. Принципы электрокардиографии.

Понятие и диполях. Математическое описание диполей. Дипольный момент. Поля, создаваемые диполями. Модель сердца Эйнтховена. Построение треугольников Эйнтховена, объяснение формирования зубцов на электрокардиограмме. Отведения. Анализ электрокардиограммы. Возможные отклонения.

Тема.2. Электроэнцефалография. Общий принцип ЭЭГ. Положения электродов. Формирование зубцов. Типы ритма на ЭЭГ. Анализ ЭЭГ. отклонения при патологиях.

Тема 3. Механические колебания и волны. УЗИ.

Основные уравнения, описывающие колебательные процессы. Затухающие и незатухающие колебания. УЗИ: принцип, проведение. Допплеркардиография: принцип метода, оценка метода, техника проведения исследований. Анализ данных.

Тема 4. Элетричество и магнетизм. Томография.

Электромагнитные колебания. Основные законы, описывающие действие магнитного поля. Использование в медицинских исследованиях. Магниторезонансная томография – принцип метода, использование, анализ данных.

Шкала электромагнитного излучения. Использование различных типов излучения в биомедицинских исследованиях и терапии заболеваний.

Раздел 3. Биофизические методы исследований и методы молекулярной биологии

Тема 1. Интерференция и дифракция света. Рентгеноструктурный анализ.

Общая характеристика интерференции и дифракции. Построение дифракционных интерференционных картин. Законы интерференции и дифракции, математическое описание. История развития метода рентгеноструктурного анализа. Основные уравнения, описывающие взаимодействие ЭМ волн с кристаллами вещества/белка. Возможности метода, техника проведения исследований.

Тема 2. Основные законы люминесценции. Использование в исследованиях.

Общая характеристика поглощения света веществом, флюоресценции и фосфоресценции. Уравнения люминесценции. Спектры флюоресценции, их анализ. Возможности метода.

Тема 3. Методы молекулярной биологии.

Основные приемы работы с компонентами клетки. Разделение клеточных структур с использованием дифференциального центрифугирования. Эксперименты с «выбиванием» генов (knockout). Полимеразная цепная реакция: описание метода, использование в биологических исследованиях и судмедэкспертизе. Использование рестриктаз для анализа генома. Метод блоттинга. Футпринтинг, использование метода для идентификации протеин-связывающих участков биополимеров. Хроматографические методы.

Практические занятия № 1-2 (8 часов)

тема: «Иммунитет. Основные диагностические показатели иммунной системы человека»

Цель работы: знакомство с основными методами определения показателей крови в лабораторной диагностике


  1. Определение количества лейкоцитов

Кровь добывают из мякоти пальца руки, применяя одноразовые скарификаторы. Предварительно мякоть пальца дезинфицируют. Первую каплю крови удаляют ваткой. Кровь насасывают в смеситель с меткой 11 над расширением до метки 0.5. Смеситель держат наклонно, чтобы избежать попадание воздуха в капилляр. Прилипшую к наружной поверхности капилляра кровь вытирают ваткой.

Далее уже до метки 11 набирают раствор состава: ледяная уксусная кислота – 3 мл, 1% раствор метиленовой синьки – 3 мл, дистиллированная вода – 300 мл. Уксусная кислота гемолизирует эритроциты, это облегчает подсчет лейкоцитов. Смеситель интенсивно встряхивают в течение 5 мин в горизонтальном положении. (Примечание – в экспериментах можно обойтись без метиленовой синьки, которая, однако, облегчает идентификацию лейкоцитов).

Притирают камеру Горяева, затем, выпустив из смесителя первую порцию крови, аккуратно наносят на край камеры каплю, которая в силу капиллярности распределяется под притертым стеклом.

Лейкоциты считают при малом увеличении микроскопа в 100 больших квадратах (1600 малых), двигаясь по диагонали камеры Горяева. Концентрацию лейкоцитов определяют по формуле :

Число лейкоцитов=(∑/1600)*4000*20.

Сделать вывод по полученным данным.

Контрольные вопросы:


  1. Основные лейкоциты крови человека

  2. Причины увеличения/уменьшения количества лейкоцитов в крови

  3. Общее количество лейкоцитов в норме и при патологиях

  1. Определение лейкоцитарной формулы

Кровь добывают из мякоти пальца, используя одноразовые скарификаторы. Предварительно мякоть пальца дезинфицируют. Первую каплю крови удаляют ваткой.

Каплю крови наносят на тщательно обезжиренное предметное стекло и вторым стеклом делают тонкий мазок крови, держа стекло под углом около 40 0 (чем меньше угол наклона, тем тоньше мазок). Мазок крови должен быть толще вначале и тоньше с противоположного края (этот край мазка сразу же должен начать подсыхать).

После высыхания мазка на его поверхность наносят спирт для фиксации, затем, после высыхания спирта, краситель Гимза-Романовского (разведение с буфером 1:10), Через 20 мин окрашивания аккуратно смывают краситель тонкой струей воды, просушивают мазок и просматривают под увеличением *90 (используя иммерсию).

Пользуясь счетчиком, определяют лейкоцитарную формулу.

Сделать вывод по полученным данным.

Контрольные вопросы:



  1. Иммунитет специфический и неспецифический

  2. Клеточный неспецифический иммунитет, основные типы гранулярных лейкоцитов, их строение и функции

  3. Моноциты и ЕК клетки – строение и функции

  4. Специфический иммунитет: Т- и В- лимфоциты

  5. Лейкоцитарная формула в норме и при патологиях, причины сдвигов лейкоцитарной формулы

  1. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови человека

Гепаринизированную кровь раскапывают по 100 мкл в лунки планшета для иммунологических реакций. В каждую лунку добавляют небольшое количество разведенных в физиологическом растворе пекарских дрожжей S. cerevisiae. Планшет инкубируют в термостате при 370С в течение 30 мин. На 20-й и 30-й минутах инкубации берут кровь из лунок планшета и делат мазки (см. предыдущую работу). После фиксации и окрашивания с помощью счетчика определяют: а) фагоцитарную активность – количество лейкоцитов, фагоцитирующих дрожжевые клетки, из 100 встреченных при просмотре, б) фагоцитарный индекс – среднее количество дрожжевых клеток, поглощенных одним лейкоцитом (для этого сумму поглощенных дрожжевых клеток делят на фагоцитрный индекс).

По полученным данным сделать выводы.

Контрольные вопросы:


  1. Специфический и неспецифический эндоцитоз

  2. Опсонизация, основные опсонины крови

  3. Фагоцитарная активность лейкоцитов в норме и при патологии

  4. Определение фагоцитарной активности в клинической практике

4. Определение титра антител

В штатив размещают ряд из 8 или более пробирок. В первую вносят 0.2 мл сыворотки, в остальные - такой же объем 0.9%-ного стерильного раствора натрия хлорида. Во вторую пробирку к разбавителю добавляют 0.05 мл цельной крови и и тщательно перемешивают содержимое пробирки пипетированием. Стандартный объем (0.2 мл) смеси переносят в следующую (третью) пробирку, тщательно смешивают с разбавителем и переносят в четвертую, и так далее до предпоследней пробирки ряда, из которой стандартный объем смеси удаляют. В результате получают серию разведении, в которой содержание исходной сыворотки (и соответственно антител) убывает в геометрической прогрессии 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:64 и более. После внесения 0,2 мл жидкости в очередную пробирку пипетку заменяют на новую.

Помещают пробирки в термостат на 30 мин 37°С. Контролем служат сыворотка и кровь без сыворотки (первая и последняя пробирки ряда). Штатив с пробирками вынимают из термостата и проводят предварительную оценку реакции.

Учет реакции проводят по четырехбалльной системе:
"++++" - полная агглютинация (осадок рыхлый в виде зонтика, жидкость над 

осадком прозрачная, при встряхивании видны хлопья или зерна различной 

величины);

"+++" - полная агглютинация (осадок такой же, надосадочная жидкость менее 

прозрачна);

"++" - неполная агглютинация (осадок небольшой, надосадочная жидкость 

непрозрачная);

"+" - следы агглютинации (осадок незначительный, надосадочная жидкость 

непрозрачная);

"-" - отрицательная реакция (осадка нет, взвесь равномерно мутная).
В контроле антигена - осадка нет, взвесь равномерно мутная. Наивысшее 

разведение исследуемой сыворотки, в которой происходит агглютинация добавленных эритроцитов при оценке не менее, чем на два креста, считают ее титром.

Контрольные вопросы:

  1. Использование метода агглютинации в лабораторной диагностике. Прямая и непрямая агллютинация.

  2. Метод преципитаципитации, его варианты в медицинских и биологических исследованиях.


Расшифровка иммунограммы - лейкоцитоз и лейкопения

Лейкоциты

Норма - 3,5 - 8,8 109

Повышение числа лейкоцитов - лейкоцитоз, снижение - лейкопения.



Лейкоцитоз может быть физиологическим и патологическим, первый возникает у здоровых людей, второй - при каких-то болезненных состояниях.

Причины физиологического лейкоцитоза:

  1. прием пищи (при этом число лейкоцитов не превышает 10 - 12 109/л)

  2. физическая работа, прием горячих и холодных ванн

  3. беременность, роды, предменструальный период

По этой причине кровь нужно сдавать натощак, перед "походом в больницу" не стоит заниматься тяжелой физической работой. Для беременных, рожениц и родильниц установлены свои нормы. То же самое относится и к детям.

Причины патологического лейкоцитоза:

  1. инфекционные заболевания (пневмония, сепсис, менингит, пиелонефрит и т.д.), инфекционные заболевания с преимущественным поражением клеток иммунной системы (инфекционный мононуклеоз и инфекционный лимфоцитоз), различные воспалительные заболевания, вызываемые микроорганизмами (перитонит, флегмона и т.д.)

Исключения:

    • некоторые инфекционные заболевания, протекающие с лейкопенией (брюшной тиф, малярия, бруцеллез, корь, краснуха, грипп, вирусный гепатит в острой фазе)

    • если в острой фазе инфекционного заболевания отсутствует лейкоцитоз - это неблагоприятный признак, свидетельствующий о слабой реактивности (сопротивляемости) организма

  1. воспалительные заболевания немикробной этиологии (ревматоидный артрит, системная красная волчанка и др.)

  2. инфаркты различных органов (миокарда, легких и т.д.) - в их основе лежит асептическое (безмикробное) воспаление

  3. обширные ожоги

  4. большая кровопотеря

  5. злокачественные заболевания (онкология)

Исключения:

    • метастазы в костный мозг могут нарушать кроветворение и вызывать лейкопению

  1. пролиферативные (лат. proles потомство + ferre нести = разрастание ткани организма в результате новообразования (размножения) клеток) заболевания системы крови (лейкозы и т.д.), но это относится только к лейкемической (более 50 - 80 109/л лейкоцитов) и сублейкемической (50 - 80 109/л лейкоцитов) формам.

Исключения:

    • при лейкопенической (содержание лейкоцитов в крови ниже нормы) и алейкемической (содержание лейкоцитов в крови ниже нормы, отсутствие бластных (незрелых) клеток) формах, лейкоцитоза не будет

  1. уремия, диабетическая кома

  2. спленэктомия (удаление селезенки) - лейкоцитоз 15 - 20 109/л с увеличением количества нейтрофилов до 90%

Причины лейкопении:

  1. воздействие некоторых химических веществ (например, бензола)

  2. прием некоторых лекарственных препаратов (амидопирина, бутадиона, реопирина, сульфаниламидов, цитостатиков и др.)

  3. воздействие ионизирующего излучения (рентгеновское излучение, радиация)

  4. нарушение кроветворения [его недостаточность - гипоплазия костного мозга (от лат. hypo - под, ниже, меньше + гр. plasis - образование = недоразвитие какой-либо ткани)].

  5. заболевания крови (лейкозы) - лейкопеническая и алейкемическая формы, а также другие формы при передозировке цитостатиков

  6. метастазирование опухолей в костный мозг

  7. заболевания селезенки при которых происходит повышенное разрушение клеток крови в этом органе (например, цирроз печени, протекающий со спленомегалией (увеличение селезенки), лимфогранулематоз

  8. некоторые эндокринные заболевания (акромегалия, болезнь и синдром Кушинга)

  9. некоторые инфекционные заболевания, протекающие с лимфоцитопенией (брюшной тиф, малярия, бруцеллез, корь, краснуха, грипп, вирусный гепатит в острой фазе).

Лейкоцитарная формула крови

Ядерный сдвиг лейкоцитарной форумы - изменение нормального процентного соотношения различных групп лейкоцитов нейтрофильного ряда.


Можно выделить:
1. Ядерный сдвиг нейтрофилов влево говорит о появлении в крови молодых форм нейтрофилов, что бывает при:

  • инфекционных заболеваниях,

  • воспалительных процессах,

  • раке,

  • интоксикациях.

По типу ядерного сдвига различают:
Регенеративный сдвиг.
Увеличено количество палочкоядерных и юных нейтрофилов на фоне общего повышения лейкоцитов.
Это показатель повышенной яктивности костного мозга, которая наблюдается при воспалительных и гнойно-септических заболеваниях;
Дегенеративный сдвиг.
Увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов? появление дегенеративных изменений в клетках.
Такой сдвиг говорит о функциональном угнетении костного мозга, что может протекать как с повышением лейкоцитов, так и со снижением лейкоцитов.
Дегенеративный сдвиг при общем лейкоцитозе бывает при:

  • сальмонеллезе,

  • токсической дизентерии,

  • остром перитоните,

  • уремической и диабетической комы.

Дегенеративный сдвиг на фоне снижения лейкоцитов бывает при:

  • вирусных инфекциях,

  • тифопаратифозных заболеваний.

Лейкемоидные реакции характеризуются появлением незрелых форм: миелоцитов, промиелоцитов и даже миелобластов на фоне выраженного лейкоцитоза.
Бывает при:

  • инфекциях,

  • туберкулезе,

  • раке желудка, молочной железы, толстой кишки.

Отношение всех несегментированных форм лейкоцитов к сегментированным называется "индексом сдвига" нейтрофилов и определяется по следующей лейкоцитарной формуле крови:
Индекс сдвига = (М+Ю+П)/C, где
М - миелоциты, Ю - юные нейтрофилы, П - палочкоядерные, С - сегментоядерные нейтрофилы.
В норме индекс сдвига равен 0,05-0,08.
Тяжесть степени заболевания по индексу сдвига: - тяжелая степень - индекс от 1,0 и выше, - средней степени - индекс 0,3-1,0,

  • легкая степень - индекс не более 0,3.

2. Ядерный сдвиг нейтрофилов вправо - среди нейтрофилов преобладают зрелые формы с 5-6 сегментами вместо обычных трех.
Индекс сдвига - менее 0,04.
Ядерный сдвиг нейтрофилов вправо встречается:

  • в норме у 20 процентов практически здоровых людей,

  • при аддисонобирмеровской анемии,

  • полицетемии,

  • при лучевой болезни.

Ядерный сдвиг нейтрофилов вправо при инфекционных и воспалительных заболеваниях указывает на благоприятное течение.

Практические занятия № 3-4 (8 часов)

Тема: Иммунологические методы диагностики (продолжение)

  1. Выявление субпопуляций лимфоцитов

Теоретическая часть. Популяцию лимфоцитов в организме можно разделить на несколько групп, обладающих специфическими функциями. ЕК-клетки сразу включаются в иммунную реакию, их действие направлено в основном против опухолевых и зараженных вирусами клеток.

Т-лимфоциты подразделяются на две группы: 1) CD4+ - Т-хелперы, 2) CD 8+ - Т-киллеры. Первые обеспечивают протекание иммунного процесса благодаря продукции лимфокинов, вторые осуществляют цитотоксическое действие на клетки.

В-лимфоциты – при активации превращаются в плазмоциты – продуценты антител.

Оценка количественного соотношения лимфоцитов имеет важное значение, как диагностический показатель состояния иммунной системы.

а) Подсчет количества Т-лимфоцитов. К особенностям Т-лимфоцитов можно отнести: 1) наличие рецепторов к эритроцитам барана, 2) способность к бластной трансформации (дедиффиренцировка при активации), 3) Т-хелперы имеют рецепторы к IgM, Т-киллеры – к IgG. Тест розеткообразования – классический метод определения Т-лимфоцитов всех классов – основан на наличии в мембране Т-лимфоцитов рецепторов к эритроцитам баранов и способности к образованию с этими эритроцитами прочных комплексов – т.н. розеток (рис. 1).

Рис. 1. Розетка – структура, состоящая из центрального лимфоцита и прикрепленных к нему эритроцитов числом более 4-х.



  1. Определение абсолютного количества/процентного содержания Т-лимфоцитов

Ход работы. 1) 10 мл крови пациента центрифугируют в режиме 3000 об/мин 10 мин, в результате внизу центрифужной пробирки собирается слой эритроцитов, вверху – плазма, а между ними – тонкий желтоватый слой лейкоцитов. Необходимо аккуратно собрать клетки этого слоя. 2) Концентрацию лейкоцитов довести до 3-5*106/мл. 3) Смешать взвесь лейкоцитов с суспензией эритроцитов барана в соотношении 1:1. 4) Полученную смесь инкубируют при 37°С в течении 10 минут и снова центрифугируют, после чего выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С в течение 2-х часов. 5) Подсчет клеток производят в камере Горяева. Подсчитывают число “розеток” на 100 лимфоцитов и определяют процентное содержание Т-лимфоцитов. Для определения абсолютного количества Т-лимфоцитов в день исследования производят общий клинический анализ крови.

В норме содержание Т-лимфоцитов в периферической крови колеблется от 50 до 70% от общего количества лимфоцитов (в среднем 54,3±1,0%).



  1. Определение активных Т-лимфоцитов

Активные Т-лимфоциты — это клетки, способные к спонтанному розеткообразованию без предварительной инкубации. Ход исследования тот же, что и при определении общего числа Т-лимфоцитов, за исключением этапа инкубации. В норме в периферической крови содержится от 23 до 40% активных Т-лимфоцитов (в среднем 34,6±1,9%).

  1. Определение субпопуляций Т-лимфоцитов

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов основано на выявлении так называемых теофиллинчувствительных и теофиллинрезистентных лимфоцитов. Клеточные мембраны Т-супрессоров имеют рецепторы к теофиллину, который при взаимодействии с клеткой ингибирует реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана. Т-хелперы таких рецепторов не содержат, поэтому при взаимодействии с эритроцитами барана даже при добавлении теофиллина образуются “розетки”.

Методика количественного определения Т-супрессоров и Т-хелперов мало отличается от описанного выше теста розеткообразования, за исключением добавления в инкубационную среду раствора теофиллина. При этом Т-супрессоры (теофиллинчувствительные клетки) теряют способность розеткообразования с эритроцитами барана, а Т-хелперы (теофиллинрезистентные клетки) такую способность сохраняют (рис. 2). http://medbook.medicina.ru/images/405/132366/r1_112.gif

Рис. 2. Механизм определения CD8+ и CD4+ клеток в тесте розеткообразования с теофиллином.


  1. Иммунизация животного с целью получения антисыворотки к антигенам главного комплекса гистосовместимости

Цель работы: освоить методику получения антисыворотки к антигенам ГКГ.

Белки главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) играют существенную роль в реакции отторжения тканей после трансплантации. Используя антитела против этих белков, можно оценить степень иммунологического родства организмов. Ниже приводится метод получения таких антител на примере животных. Аналогичный способ используется для человека.



  1. Берут 2-х крыс – донора и реципиента, усыпляют при помощи эфирного наркоза.

  2. Хвост крысы - донора тщательно протирают ваткой с 90% спиртом.

  3. Снизу хвоста донора делают продольный разрез, затем – 2 кольцевых и выделяют 2 квадратных участка кожи хвоста со стороной примерно 5 мм

  4. В подлопаточных областях крысы – реципиента оттягивают кожу и вырезают из нее участок чуть больший, чем кусочки кожи крысы – донора.

  5. Помещают кожу донора в подлопаточные области реципиента эпителием вверх, расправляют и накладывают вазелиновую марлевую повязку.

  6. Примерно через 2 – 3 недели в норме начинается отторжение пересаженных кусочков кожи, начиная со второй недели у реципиента можно брать кровь для получения антисыворотки к антигенам ГКГ.

  1. Определение антителообразующих клеток методом локального гемолиза в геле

Метод используется для подсчета антителообразующих клеток в случае их малой концентрации в образце.

Ход работы:



  1. Приготовить суспензию трижды отмытых эритроцитов в растворе Хенкса, соедржание эритроцитов в суспензии довести до 20% (взять 1 часть упакованных эритроцитов и 4 части раствора Хенкса).

  2. Чашки Петри покрыть слоем агара (предварительно прогретого до 450С), 10 мл/чашку.

  3. Отцентрифугировать кровь, в которой определяются антителообразующие клетки (3 тыс об./мин, 10 мин), для эксперимента взять слой лейкоцитов, расположенных между плазмой и нижним слоем эритроцитов, определить концентрацию лейкоцитов, приготовить мазок и определить процентное содержание лимфоцитов, далее подсчитать концентрацию лимфоцитов в образце.

  4. В пробирку налисть 2 мл агара (при 450С), 0.1 мл суспензии эритроцитов, 0.05 мл суспензии лимфоидных клеток. Смесь вылить в чашки Петри на нижний слой агара.

  5. После застывания инкубировать чашки 1,5 часа при 370С, затем на поверхность агара налить сыворотку крови морской свинки (источник комплемента), разбавленную 1/10 раствором Хенкса, инкубировать при 370С еще 30 мин.

  6. Чашки оставить при комнатной температуре еще на 1,5 часа, затем слить комплемент и подсчитать зоны гемолиза.

  7. Вычислить относительное количество антителообразующих клеток на 100 лимфоцитов.

Контрольные вопросы: 1) Для чего при выявлении антителообразующих клеток методом локального гемолиза в геле используют сыворотку крови морской свинки?

2) Почему эритроциты барана агглютинируют вокруг Т-лимфоцитов?

3) Перечислите основные типы реакций отторжения трансплантата.

ВОПРОСЫ К ЗАЧЕТУ


  1. Методы иммунодиффузии: принцип, возможности.

  2. Методы иммунофореза: принципы, возможности.

  3. Локальный гемолиз в геле при иммунологических исследованиях.

  4. Реакция агглютинации, использование, возможности методов, основанных на агглютинации.

  5. Титрование комплемента. Лимфоцитолиз.

  6. Выделение популяций гранулоцитов и лимфоцитов.

  7. Выделение лейкоцитов из крови.

  8. Теория Эйнтховена. Возникновение зубцов на ЭКГ.

  9. Анализ электрокардиограммы.

  10. Электроэнцефалограмма: принцип метода, типы волновой активности.

  11. Математическое описание волновых процессов. УЗИ.

  12. Допплеркардиография: принцип метода, анализ данных, варианты проведения.

  13. Магнитное поле: математическое описание.

  14. Магниторезонансная томография: принцип и возможности метода.

  15. Дифракция и интерференция света.

  16. Рентгеноструктурный анализ.

  17. Флуоресцентный анализ.

  18. Принцип и использование метода ПЦР.

  19. Блоттинг и футпринтинг.

  20. Хроматография.

Литература

Иммунологические методы под ред. Х. Фримеля. М.:Мир. 1979.519 с.

Федорова В.Н., Степанова Л.А. Краткий курс медицинской и биологической физики с элементами реабитологии. М.:Физматлит. 2008. 623 с.

Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия в 3-х т. М.:Мир. 1985.



Методы исследований в иммунологии под ред. Лефковитса И. и Перниса Б. М.:Мир. 1981. 486 с.

Фундаментальная и клиническая физиология под ред. Камкина А. и Каменского А. М.:Академия. 1073 с.

Похожие:

Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconРабочая программа учебной дисциплины «Физико-химические методы исследования и техника лабораторных работ»
Рабочая программа учебной дисциплины может быть использована для переподготовки средних медицинских работников по разделам: «Физико-химические...
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconПрограмма дисциплины дпп. Дс. 03 Физико-химические методы анализа
Данная дисциплина должна вооружить студентов разнообразными методиками химического эксперимента, приобрести опыт экспериментальной...
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconРабочая учебная программа по дисциплине физико-химические методы в медицине по направлению подготовки
...
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconКнига позволит быстро получить основные знания по предмету, повторить пройденный материал, а также качественно подготовиться и успешно сдать зачет и экзамен. Рекомендуется всем изучающим и сдающим дисциплину «Аналитическая химия и физико-химические методы
Аналитическая химия и физико­химические методы анализа: Шпаргалка. — М.: Риор, 2007. — 47 с
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconКнига позволит быстро получить основные знания по предмету, повторить пройденный материал, а также качественно подготовиться и успешно сдать зачет и экзамен. Рекомендуется всем изучающим и сдающим дисциплину «Аналитическая химия и физико-химические методы
Аналитическая химия и физико-химические методы анализа: Шпаргалка. — М.: Риор, 2007. — 176 с
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconВопросы для подготовки к экзамену по дисциплине «аналитическая химия и физико-химические методы анализа»
«аналитическая химия и физико-химические методы анализа» для студентов I курса заочного отделения
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconРабочая программа по дисциплине ен. Ф. 06 «Аналитическая химия и физико-химические методы анализа»
«Производство продуктов питания из растительного сырья и для специальностей 270900 «Технология мяса и мясных продуктов», 271100 «Технология...
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconКонтрольные вопросы по дисциплине «Аналитическая химия»
Предмет аналитической химии. Новые направления современной аналитической химии (химические, физико-химические и физические методы...
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconРабочая программа по биологии Вараксиной Л. А. Моу «Средняя общеобразовательная русско-татарская школа №161 Советского района города Казани»
Согласно действующему Базисному плану рабочая программа для 7-ого класса предусматривает обучение биологии в объеме 2 часа в неделю,...
Рабочая программа Дисциплина: физико-химические методы в биологии iconРабочая программа дисциплины методы оптимальных решений математический цикл, базовая часть Направление подготовки
Дисциплина «Методы оптимальных решений» по учебному плану является базовой дисциплиной федерального государственного образовательного...
Разместите кнопку на своём сайте:
ru.convdocs.org


База данных защищена авторским правом ©ru.convdocs.org 2016
обратиться к администрации
ru.convdocs.org