Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона



Скачать 337.26 Kb.
страница1/3
Дата26.07.2014
Размер337.26 Kb.
ТипДокументы
  1   2   3
mymio_logo.jpg

Восстановление экспрессии дистрофина в клетках mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона.

  1. Carmen Bertoni1,

  2. Catherine Lau1 and

  3. Thomas A. Rando1,2,*

+ Author Affiliations

  1. 1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA and

  2. 2GRECC, VA Palo Alto Health Care System, Palo Alto, CA, USA

  • Received December 15, 2002.

  • Accepted March 18, 2002

В большинстве случаев мутации приводящие к миодистрофии Дюшена представлены большими делециями, что приводит к сдвигу рамки считывания. В результате в мышцах таких индивидов отсутствует или значительно снижено содержание дистрофина Любое лечебное воздействие, которое может восстановить рамку считывания, потенциально способно уменьшить серьезность болезни, позволяя производить частично функциональный дистрофин, как встречается при мышечной дистрофии Беккера (МДБ). Один подход к восстановлению рамки считывания должен был бы изменить соединение пре мРНК, чтобы произвести изменения в структуре. Мы проверили способность РНК/ДНК олигонуклеатидов (химеропластов) изменить ключевые основы в определенных последовательностях в гене дистрофина, чтобы вызвать пропуск экзона. Используя клетки mdx мыши как модель болезни, мы показываем, что химеропласт-опосредованное преобразование в соединении интрон22/экзон 23 вызывает альтернативное соединение и производство транскриптов. Действительно, множественные формы дистрофина наблюдались вестерн-блот-анализом, и функциональность продуктов была продемонстрирована восстановлением экспрессии и локализацией дистрофин-связанного белка, α-дистрогликана, в дифференцированных клетках. Эти данные демонстрируют, что химеропласты могут вызвать пропуск экзона, изменяя последовательности места соединения на геномном уровне. Также, у химеропласт-опосредованного пропуска экзона есть потенциал, который будет использоваться, чтобы преобразовать тяжелый фенотип МДД в намного более умеренный фенотип МДБ.

Предисловие

Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) и Беккера (МДБ) являются болезнями мышц с Х сцепленным рецессивным типом наследования, вызванными дефектами в гене на 2.5 МБ, который кодирует белок дистрофин. (1). Больше чем у 80 % пациентов с МДД или МДБ есть большие делеции в гене дистрофина, дупликации, маленькие делеции, вставки и точечные мутации составляют остальные случаи (2). В общем тяжелый фенотип МДД вызван мутациями, такими как делеции сдвига рамки считывания и точечные мутации, вызывающие дефицит дистрофина.

Более умеренный фенотип МДБ обычно коррелирует с делециями, которые сохраняют рамку считывания и производит внутренне измененый, но частично функциональный, дистрофин(3). Таким образом у любого лечебного воздействия, которое могло преобразовать мутацию со сдвигом рамки считывания в мутацию без сдвига рамки считывания, есть потенциал, чтобы преобразовать тяжелый фенотип МДД в более умеренный фенотип МДБ.

Наиболее широко изученные стратегии по восстановлению экспрессии дистрофина у дистрофин дефицитных мышцей используют вирусную поставку функциональной комплементарнойой ДНК , кодирующей дистрофин (47). Этот подход был эффективен на моделях животных и дает надежду для применения у людей. Кроме того этот подход применим к лечению любого типа мутации МДД, не только делецию сдвига рамки считывания. Однако, вирусные системы доставки сталкиваются с трудностями, такими как врожденный иммунный ответ против векторов, проблемы, связанные с вирусной интеграцией в геном, и адекватным регулированием экспрессии поставленного гена. Несколько групп исследователей изучают возможность использования антисмысловых олигонуклеотидов, чтобы изменить обработку транскрипта дистрофина, и вызвать пропуск экзона и мутации со сдвигом рамки считывания перевести в мутации без сдвига рамки считывания (812). Эта технология избегает некоторых из препятствий вирусной опосредованной генотерапии. Однако, этот подход потребовал бы повторенной поставки олигонуклеотидов, чтобы поддержать экспрессию дистрофина, или возникнет потребность в длительной экспрессии антисмыслового транскрипта, как могло бы быть достигнуто с вирусной системой доставки (8). Привлекательная альтернатива антисмысловому пропуску экзона восстановление трансляционной рамки считывания, которая была бы генной стратегией модификации. Текущие генные стратегии репарации, которые могли быть применены к этой проблеме, включают технологии, вовлекающие химерные олигонуклеатиды, одноцепочечные ДНК олигонуклеатиды, и гомологичные короткие фрагменты (13,14).

Генная репарация, вовлекающая химерные РНК/ДНК олигонуклеатиды (химеропласты), основана на активности этих векторов вызвать преобразования пары оснований на геномном уровне (15). Их механизм действия вовлекает использование врожденной репарации в клетке, направляя замену единственного основания в определенной последовательности ДНК (16,17). Химеропласт-опосредованная генная репарация была успешно применена к различным типам клеток, и in vitro и в естественных условиях (1825). Хотя прежде всего изучено применение для того, чтобы восстановить точечные мутации, у химеропласт-опосредованных последовательностей также есть потенциал, чтобы изменить соединение и таким образом восстановить рамку считывания в гене с мутацией со сдвигом рамки считывании

Хотя прежде всего изучено применение для того, чтобы восстановить точечные мутации, у химеропласт-опосредованных преобразований последовательностей сайтов сплайсинга также есть потенциал, чтобы изменить сплайсинг и таким образом восстановить трансляционную рамку считывания в гене с мутацией со сдвигом рамки считывания.

В этом отчете мы исследовали возможность использования химеропластов, чтобы изменить сплайсинг гена дистрофина. У образцовой системы, mdx мыши, есть мутация в экзоне 23 гена дистрофина, которая ведет к отсутствию белка дистрофина. Мы ранее показали, что химеропласты в состоянии исправить эту точечную мутацию и in vitro и в естественных условиях (20,21). Мы проверили, могла ли мутация единственного основания в интроне 22/экзон 23 соединении изменить сплайсинг транскрипта дистрофина с пропуском экзона 23. Предсказанный продукт, в котором экзон 22 непосредственно соединен к экзону 24, произвел бы белок дистрофин почти во всю длину. Хотя у mdx мышей нет делеции сдвига рамки считывания, они обеспечивают возможность заняться исследованиями того, как устойчивые, одно-основные перестройки геномной ДНК могут использоваться, чтобы переадресовать соединение, которое было бы применимо к мутациям со сдвигом рамки считывания в гене дистрофина. Мы нашли, что, изменяя интрон 22/экзон 23 соединения действительно выдают транскрипты в структуре и сокращенные формы белка дистрофина. Эти исследования расширяют терапевтическое применение химеропласт-опосредованных замен единственного основания для делеций сдвига рамки считывания. mymio_logo.jpg



Результатыmymio_logo.jpg

Планирование химеропласта, названного MDX3 (Рис. 1A), было разработано, чтобы вызвать преобразование G-T в экзоне 23 места акцептора интрона 22/экзон 23 соединения в гене дистрофина мыши (Рис. 1B). Изменеие основания, на которое нацелен MDX3, закончилась бы разрушением интрона 22/экзон 23 последовательности и создало бы новый сайт рестрикции в этом положении (Рис. 1B). Предсказанная последовательность транскрипта в результате соединения экзона 22 с экзоном 24 была бы в рамке и приводила к синтезу белка на 71 аминокислоту короче чем дистрофин во всю длину. Как контроль, мы использовали химерный олигонуклеотид, MDX4 (Рис. 1A), разработанный совершенно комплементарным к интрону 22/экзон 23 и таким образом не имеющий никакой активности и не вызывающий изменение геномной последовательности



figure

Большая версия изображения



In this page

In a new window

Download as PowerPoint Slide

Рисунок 1

Признаки химеропласт-опосредованной замены одного основания на геномном уровне

Специфичность MDX3 вызвать преобразование G-T в интроне 22/экзоне 23 была оценена, используя пробу ARMS геномной ДНК. Клетки были поддержаны в культуре в течение по крайней мере 15 дней после трансфекции химеропласта. Используя инициаторы ПЦР, разработанные, чтобы усилить последовательность, имеющую трансверсию G-T, мы наблюдали определенный продукт амплификации только в клетках, инфицированных вирусом с целевым химеропластом (Рис. 2A). Клетки, инфицированные вирусом с контрольным химеропластом или неинфицированными вирусом клетками, были не в состоянии произвести любой продукт амплификации, используя эти инициаторы.



figure

Большая версия изображения



In this page

In a new window

Download as PowerPoint Slide

Рисунок 2..

Преобразование G-T целевым химеропластом было также подтверждено прямым усвоением продуктов амплификации ПЦР(Рис. 2B). Инфицированные вирусом клетки были поддержаны в культуре больше 45 дней, затем геномная ДНК была извлечена. Определенные инициаторы ПЦР использовались, чтобы произвести продукт амплификации 150 bp, которые содержали интрон 22/экзон 23 соединения , которые были подтверждены прямым отщеплением. После очистки продукты ПЦР были подвергнуты перевариванию, используя Hinf I эндонуклеазы. Продукты переваривания в ожидаемом размере ∼50 и 100 bp наблюдались от клеток, инфицированных вирусом с MDX3 (Рис. 2B), демонстрируя, что нацеленые химеропласты вызвали единственную замену пары оснований.

Чтобы проанализировать далее признаки генной модификации на геномном уровне, мы непосредственно упорядочивали продукты ПЦР-амплификации интрона 22/экзон 23 соединения от клеток контроля и MDX3-инфицированного-вирусом. Преобразование G-T могло быть обнаружено после одного раундаПЦР- амплификации, и подтверждено после второго раунда амплификации, только в MDX3-инфицированных-вирусом клетках (Рис. 2C). Эти результаты были воспроизведены в 10 независимых экспериментах и были подтверждены анализом последовательности, используя и простые и обратные инициаторы. Эти результаты подтверждают изменение основания нацеленным химеропластом в субпопуляции инфицированных вирусом клеток на геномном уровне.

Экспрессия белка дистрофина в химеропласт-леченных mdx мышечных клетках

Восстановление экспрессии дистрофина было оценено спустя 3 недели после трансфекции и 24–96 часов после индукции дифференцировки как ранее описано (20). Вестерн-блоттинг используя антитела к области белка дистрофина продемонстрировал по крайней мере два различных белковых продукта, молекулярные массы которых были меньше чем дистрофин во всю длину (Рис. 3A). Антитела, направленные к C-терминальной области, подтвердили экспрессию этих двух продуктов, но также и показало наличие третьего белкового продукта еще более низкой молекулярной массы (Рис. 3A). Основанный на специфичности антител, большие продукты содержали экзон 31/32 область белка, тогда как меньший продукт не содержал. Возможно получить только грубое приближение молекулярных масс этих продуктов. Все белки двигались быстрее чем дистрофин или утрофин, таким образом устанавливая 400 kDa как верхний предел их размеров, и все белки двигались медленнее чем самый высокий маркер молекулярной массы 200 kDa, таким образом устанавливая более низкий предел. Два более тяжелых белка (Рис. 3A) молекулярной массы были ближе к 400 kDa концам спектра, и более низкой молекулярной массы (признанный только антителом против C-терминальной области белка) двигалась ближе к 200 концам kDa. Эта структура белков дистрофина была получена в пяти независимых экспериментах и была подтверждена иммунопреципитацией. Кроме того эта структура экспрессии присутствовала в культурах мышечных клеток, полученных из MDX3-инфицированных-вирусом миобластов, которые поддерживались в течение 3 месяцев после трансфекции, подтверждая, что эффект лечения химеропластом был устойчиво унаследован.



figure

Большая версия изображения



In this page

In a new window

Download as PowerPoint Slide

Рисунок 3. mymio_logo.jpg

Мы ранее использовали вестерн-блот-анализ, чтобы количественно определить уровень экспрессии дистрофина в культурах mdx клеток, инфицированных вирусом с химеропластом, таким образом обеспечивая меру эффективности конверсии гена (20). В этом текущем исследовании, однако, наличие многократных связок на вестерн-блоттингах сделало эту меру из эффективности более трудной. Как альтернативный подход, мы построили стандартную кривую, используя смесь экстрактов из C57 и mdx мышечных волокон, чтобы определить предел нашей способности обнаружить белковую экспрессию дистрофина вестерн-блот-анализом. Согласно этим исследованиям, мог быть обнаружен дистрофин, пока процент клеток с экспрессией дистрофина был больше чем 1 %. Таким образом мы пришли к заключению, что эффективность замены одного основания установленая MDX3 химеропластом, была в диапазоне 1-5 %. Этот диапазон подобен тому, что ранее сообщалось для химеропласта, разработанного, чтобы исправить mdx мутацию (20,21) ), и находится в диапазоне химеропласт-опосредованного преобразования, показанного другими (19,23,26).

Экспрессия некоторых форм белка дистрофина в субпопуляции MDX3-инфицированных-вирусом клеток была также подтверждена иммунным окрашиванием. Последовательно с результатами вестерн-блоттинга, мы наблюдали группы дистрофин-положительных волокон после дифференцирования только в MDX3-инфицированных-вирусом клетках (Рис. 3B). Иммунное окрашивание леченных клеток с определенными для экзона анти-дистрофиновыми антителами подтвердило наличие внутренне измененных форм дистрофина в мышечных волокнах, полученных из MDX3-инфицированных-вирусом клеток (Рис. 3C), тогда как культуры мышечной волокон, полученные из неинфицированных вирусом клеток или из MDX4-инфицированных-вирусом клеток, не окрашивали положительно ни одним из антител. В культурах мышечных волокон, полученных из MDX3-инфицированных-вирусом клеток, групп мышечных волокон, положительно окрашенных антителами против C-терминальной области и экзона 31/32 области дистрофина, но ни одно из мышечных волокон, окрашенных положительно антителом против экзона 26 (Рис. 3C). Эти данные согласуются с данными о вестерн-блоттинге, указывая, что изменение интрона 22/экзон 23 места соединения заканчивается многократным пропуском экзонов, не только экзона 23 (Рис. 3A). Многократный пропуск экзона, как наблюдали другие исследователи, использующие антисмысловые олигонуклеатиды, вмешался в интрон 22/экзон 23 соединения (9).

Восстановление экспрессии α-дистрогликана

Как было показано экспрессия α-дистрогликана (α-DG), большого компонента дистрофин-гликопротеинового комплекса снижено до 80-90% у mdx мышей из-за нехватки дистрофина (27). Мы использовали иммунное окрашивание, чтобы определить, могли ли белки дистрофина, произведенные разрушением интрона 22/экзон 23 соединения, восстановить экспрессию α-DG. Иммунное окрашивание MDX3-инфицированных-вирусом культур, которые дифференцировались в течение 4 дней, подтвердило локализацию α-DG в мембране сарколеммы в группах мышечных волокон (Рис. 4). Эти результаты ясно демонстрируют, что по крайней мере один из произведенных белков был функционален, совместим с функциональными свойствами спроектированных дистрофинов (28).



figure

Большая версия изображения:



In this page

In a new window

Download as PowerPoint Slide

Рисунок 4.

Обнаружение измененных продуктов сплайсинга, вызванных MDX3mymio_logo.jpg

Основанное в иммунном окрашивании и иммуноблот-анализе использование определенных для экзона антител, мы идентифицировали продукты измененного сплайсинга из-за пропуска экзона 23. Мы использовали анализ RT–PCR, чтобы идентифицировать продукты измененного сплайсинга, вызванные разрушением интрона 22/экзон 23 места соединения в клетках, которые были поддержаны в культуре спустя 2 недели после трансфекция химеропласта. Мы проектировали определенные инициаторы, перекрывающие экзон 22 до экзона 32 из гена дистрофина. Продукты, представляющие транскрипты во всю длину, были амплифицированны от невылеченных и химеропласт-леченных клеток, используя эти инициаторы (Рис. 5). Мы были неспособны обнаружить любые альтернативно соединенные транскрипты в этой области в клетках, инфицированных вирусом с целенаправленным химеропластом (Рис. 5). Отсутствие альтернативных продуктов соединения было также подтверждено введением дополнительного шага амплификации RT–PCR, используя внутренние инициаторы (данные, не показанны).mymio_logo.jpgmymio_logo.jpg



figure

Большая версия изображения:



In this page

In a new window

Download as PowerPoint Slide

Рисунок 5.

Мы поэтому расширяли наше исследование, используя инициаторы, которые охватили участок от экзона 9 до экзона 50 (Рис. 6A), таким образом покрывая почти 50 % всей ДНК дистрофина. Вторая амплификация ПЦР была выполнена, используя пары инициатора (см. Материалы и Методы и Рис. 6A), расположенный в области транскрипта ддистрофина, усиленного при первом шаге. Мы наблюдали пять продуктов (маркировал ‘b’, ‘c’, ‘d’, ‘e’ и ‘f’) в MDX3-инфицированных-вирусом клетках (Рис. 6B и C), и эта структура также наблюдалась в клетках, которые поддерживались в культуре в течение 3 месяцев после трансфекции. Ни один из этих продуктов никогда не обнаруживался в неинфицированных вирусом клетках или клетках, инфицированных вирусом с контрольным химеропластом. Прямое отщепление этих продуктов показало, что они представляли пять различных разновидностей сайтов сплайсинга, каждый пропускающий экзон 23 плюс дополнительные экзоны и вверх по течению и вниз по течению интрона 22/экзон 23 соединения, с 26 экзонами (экзоны 12–37) пропускаемый в самом маленьком продукте (Рис. 6C и D). Три из пяти разновидностей сайтов сплайсинга (продукты ‘c’, ‘d’ и ‘f’) были в структуре (Таблица 1). Предсказанные последовательности аминокислот из этих транскриптов в структуре включили бы белки между 271 и 350 kDa (Таблица 1), совместимые с диапазоном, предложенным вестерн-блот-анализом (Рис. 3A).



figure

Большая версия изображения:



In this page

In a new window

Download as PowerPoint Slide

Рисунок 6.


Primers

Full-length product size predicted

Alternate product size observed

Product label (Fig. 6)

Altered splicing

Reading frame

Predicted protein size

F19–R32

2100 bp

600 bp

b

21/31

Out-of-frame

-

F9–R32

3410 bp

900 bp

с

11/28

In-frame

331 kDa

F9–R32

3410 bp

1300 bp

d

17/31

In-frame

346 kDa

F9–R35in

3930 bp

700 bp

e

12/34

Out-of-frame



F9–R43in

5100 bp

1100 bp

f

11/38

In-frame

271 kDa


Таблица 1.

Альтернативный сплайсинг вызваный MDX3

Поскольку меньшие транскрипты избирательно амплифицированны ПЦР, интенсивность связок на гелях не отражает относительное изобилие транскриптов в клетке (см. Рис. 6B).. Это на первый план выдвигало факт, что продукт во всю длину всегда одинаково амплифицируются когда внутренние инициаторы в пределах 1-2 КБ друг от друга (например. F19/R32 в Рис. 6B), использовались в реакции ПЦР. С внутренними инициаторами, все более и более отдаленными от друг друга (например. F9/R43in или F9/R50in), только альтернативные транскрипты были усилены. Это не происходило из-за неполного ретротранскрипции, так как транскрипт во всю длину всегда одинаково усиливался, когда мы использовали пары инициатора F22/R32 (данные, не показанны). Поэтому, этот тип анализа не обеспечивает данные, которые точно отражают уровни альтернативных транскриптов относительно транскрипта во всю длину.

Неожиданное обнаружение многократных разновидностей сайтов сплайсинга, вызванных единственной изменением основания в соединении, принудило нас исследовать другие сайты сплайсинга, специфично донорские и акцепторные места для экзонов, которые заключали пропущенные экзоны для мутаций. Мы не ожидали это по двум главным причинам. Во-первых, не было никакого соответствия между последовательностями других сайтов сплайсинга и интрон 22/экзон 23 соединением. Таким образом не было бы никакого гомологичного соединения между MDX3 и ни одним из тех сайтов сплайсинга, которые могли бы привести к таким изменениям. Во-вторых, MDX4 почти идентичен MDX3 и все же не вызывал дополнительного соединения. Таким образом это было бы необычно, если бы MDX3 был способен к стимулированию мутаций на многократных, негомологичных сайтах сплайсинга вдоль гена дистрофина, тогда как у MDX4, отличающегося только единственным основанием от MDX3, не было никакой активности вообще в стимулировании мутаций. Однако, основанный на замене структуре соединения, идентифицированного в MDX3-инфицированных-вирусом клетках (Таблица 1), мы исследовали другие сайты сплайсинга на мутации. Мы PCR-амплифицировали донорский сайт сплайсинга 5 ′ экзонов и акцепторной сайт сплайсинга для 3 ′ экзонов для каждого нового соединения отдаленных экзонов друг с другом. Кроме того, мы упорядочивали и донорские и акцепторные сайты сплайсинга для первого 'пропущенного' экзона или от 5 ′ или от 3 ′ (см. Рис. 7 для примера). Вся амплификация была пройдена в два раунда перед отщеплением рисунке 2C. Рисунок 7 показывает данные о последовательности для случая, в котором было добавочное соединение между экзоном 17 и экзоном 31 (продукт ‘d’ от Рис. 6 и Таблицы 1). Не было никакого признака изменения оснований в последовательности сайтов сплайсинга или смежных последовательностях ни для одного места, даже после двух раундов амплификации ПЦР. Идентичный анализ был сделан для продуктов ‘b’, ‘c’, ‘e’ и ‘f’ (Рис. 6 и Таблица 1), ни один из которых не приводил доказательства мутаций сайтов сплайсинга. Поэтому, единственная мутация, идентифицированная в гене дистрофина среди этих 25сайтов сплайсинга, была единственной, в интроне 22/экзон 23 соединении. Эти данные предполагают, что мутации в единственных сайтах сплайсинга могут иметь более широкие эффекты чем пропуск единственного экзона в соединении сложного гена как дистрофин.

figuremymio_logo.jpg

Большая версия изображения:



In this page

In a new window

Download as PowerPoint Slide
  1   2   3

Похожие:

Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconВосстановление экспрессии дистрофина в клетках mdx мышей при помощи химеропласт-опосредованного пропуска экзона

Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconУлучшение мышц при помощи пропуска экзона 51 у mdx мышей с пропуском экзона 52
Беккеру в результате пропуска экзона, мдд может быть преобразована в более умеренный фенотип мдб
Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconНанополимеры улучшают доставку олигонуклеатидов для пропуска экзона и следовательно экспрессию дистрофина в скелетных мышцах mdx мышей

Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconЦелевой пептид влияет на системный пропуск экзона в гене дистрофина и функциональное восстановление у дистрофин-дефицитных mdx мышей

Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconФункциональная стимуляция тат- атрофина у дистрофин -дефицитных мышей
Мдд. Мы решили исследовать терапевтический потенциал атрофина (утр), аутосомного-гомолога дистрофина, который исправляет все известные...
Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconОкта-гуанидин морфолино восстанавливает экспрессию дистрофина в сердечной и скелетных мышцах у mdx мышей

Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconФармакологическая активация pparβ / δ стимулирует экспрессию атрофина в скелетных мышечных волокнах и восстанавливает целостность сарколеммы у зрелых mdx мышей

Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconУлучшение сократительной функции сердца при помощи ингибирования nf-κB у утрофин/дистрофин дефицитных мышей

Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconИсследование опосредованного запоминания
Методика направлена на исследование опосредованного запоминания и его продуктивности, а также характера мыслительной деятельности,...
Mdx мышей при помощи химеропласт- опосредованного пропуска экзона iconСистемная генная терапия миодистрофии Дюшена у mdx мышей
Преобразование мышц из-за увеличения экспрессии дистрофина и восстановление функции стремились к нормальному значению. Этот подход...
Разместите кнопку на своём сайте:
ru.convdocs.org


База данных защищена авторским правом ©ru.convdocs.org 2016
обратиться к администрации
ru.convdocs.org