Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом



Скачать 76.46 Kb.
Дата14.01.2013
Размер76.46 Kb.
ТипМетодические указания
Утверждены
Минздравом СССР
22 мая 1985 г. N 3891-85
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕПИДОЦИДА НА

ОБРАБОТАННЫХ ИМ РАСТЕНИЯХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ

МЕТОДОМ
    Краткая  характеристика  препарата.  Лепидоцид - бактериальный
инсектицидный  препарат  для  борьбы  с листогрызущими насекомыми.
Действующим    началом   препарата   служат   споры   и   продукты
жизнедеятельности  бактерий  Bacillus thuringiensis Var. kurstaki.
Он практически не токсичен для теплокровных животных: при введении
в желудок ЛД   для белых мышей превышает 15 г/кг, для белых крыс -
            50
9,7  +/-  1,9 г/кг. Споры в организме теплокровных не прорастают и
не вызывают инфекционного заболевания. Препарат представляет собой
аморфный  порошок кремового цвета со слабым специфическим запахом.
В воде образует нестойкую суспензию.
Принцип метода. В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях

положены реакция взаимодействия антигена из спор микроорганизма с меченными флюоресцеином

антителами и выявление спор в люминесцентном микроскопе по специфическому свечению.

Использован непрямой иммунофлюоресцентный метод.
    Метрологическая  характеристика  метода.  Предел  обнаружения:
одна  спора  в  50  полях  зрения,  что  соответствует  (при титре
              11                                                 3
лепидоцида  10    спор/г) 0,01 мкг препарата на 1 г пробы, или 10
спор на 1 г пробы. Ошибка метода 15%.
Избирательность метода. Метод специфичен при условии использования иммунных сывороток

против спор микроорганизма, активных в разведениях 1:160 - 1:640 и выше.
Реактивы и материалы. Этанол х.ч. Хлорид натрия, 0,85-процентный раствор.

Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сухая люминесцентная ослиная сыворотка против

глобулинов кролика производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи,
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Москва. Специфическая иммунная сыворотка кролика против спор.
    Приборы,  аппаратура,  посуда.  Люминесцентный микроскоп марки
МБИ-15  или  другой  аналогичный.  Объект-микрометр.  Центрифуга с
                            -1
частотой  вращения  12  мин.  .  Термостат  на  37 °C. Аппарат для
встряхивания.  Колбы.  Пробирки  бактериологические.  Чашки Петри.
Предметные стекла. Микропипетки.
    Подготовка  к  анализу.  Приготовление специфических сывороток
против  спор  Bacillus  thuringiensis Var. kurstaki.
Для получения
специфической  иммунной  сыворотки  проводят  иммунизацию кроликов
однократной  инъекцией  в область подколенного лимфатического узла
суспензии спор чистой культуры, прогретой в течение 1 ч на кипящей
                       9
водяной бане, в дозе 10  микробных клеток на животное. Через месяц
кроликов  реиммунизируют  второй однократной инъекцией антигена из
спор  в  область  подколенного  лимфатического узла в той же дозе.
Спустя  месяц  после  реиммунизации  проверяют  титр  сыворотки  в
непрямой  реакции  иммунофлюоресценции.  При  титре не менее 1:160
получают сыворотку в нужном количестве и используют для проведения
анализа. Сыворотки консервируют мертиолатом в соотношении  1:10000
или подвергают лиофильному высушиванию.
    Определение  титра специфической иммунной сыворотки. Из чистой
культуры  или  из  товарной  формы препарата готовят взвесь спор в
                                              7
физиологическом  растворе  в  концентрации  10   спор  в  1 мл (из
препарата готовят суспензию в разведении 1:1000).
На обезжиренные сухие предметные стекла наносят по капле взвеси и готовят из нее мазки,

равномерно распределяя каплю. После подсушивания на воздухе мазки фиксируют этанолом в

течение 30 мин., обрабатывают иммунной сывороткой в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. Далее

препараты обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика, как

описано ниже, просматривают в люминесцентном микроскопе и оценивают реакцию по

интенсивности свечения оболочки спор.
Для контроля иммунологической специфичности готовят три контрольных препарата: мазок

обрабатывают физиологическим раствором вместо иммунной кроличьей сыворотки; нормальной
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
кроличьей сывороткой; только люминесцирующей антивидовой сывороткой.
За титр сыворотки принимают ее максимальное разведение, при котором еще отмечается

четкое, "полыхающее" зеленое свечение оболочки спор. В контрольных мазках свечение оболочки

спор отсутствует. Для анализа используют сыворотки, имеющие титр не менее 1:160. Рабочим

разведением служит разведение, равное 1/2 титра, т.е. 1:80.
Отбор проб. Пробы отбирают в стерильные бумажные пакеты, сохраняют в прохладном месте

при температуре не выше 5 °C и анализируют не позднее 5 - 6 дней.
    Ход  анализа. Для анализа 1 г листьев измельчают с соблюдением
правил асептики, добавляют 15 - 20 мл стерильного физиологического
раствора  и  встряхивают  в колбе на шуттель-аппарате в течение 20
мин.  Смыв  фильтруют  через  два  слоя  стерильной марли и ваты и
                                                               -1
центрифугируют  20  мин.  при  частоте  вращения  12  тыс. мин.  .
Надосадочную  жидкость  сливают,  осадок  ресуспендируют в 0,01 мл
физиологического  раствора.  На  предметные стекла наносят 0,01 мл
суспензии  и  равномерно  распределяют  ее  на площади в 1 кв. см.
Препараты  подсушивают  на  воздухе  и  фиксируют этанолом 30 мин.
Затем    наносят   иммунную   сыворотку   против   спор   Bacillus
thuringiensis  Var.  kurstaki  в  рабочем разведении и помещают во
влажную  камеру  на  20 мин. при температуре 37 °C. Влажную камеру
создают   путем   помещения  в  чашку  Петри  фильтра,  смоченного
физиологическим раствором.
По истечении времени инкубации препараты промывают 1 - 2 мин. проточной водой,

высушивают на воздухе, а затем обрабатывают ослиной сывороткой против глобулинов кролика в ее

рабочем разведении и оставляют в контакте с ней в течение 20 мин. во влажной камере при 37 °C.

Затем препараты промывают водой 1 - 2 мин., высушивают на воздухе и просматривают в

люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом 90 x 1,25 и окуляром 4x, используя

нефлюоресцирующее иммерсионное масло.
Одновременно готовят контрольные препараты из взвеси лепидоцида 1:1000 на

физиологическом растворе и из проб, взятых на необработанных участках, которые обрабатывают по

той же схеме.
Для анализа плодов (например, яблок) исследования проводят следующим образом: целый плод

взвешивают, заливают определенным объемом стерильного физиологического раствора,

достаточного для полного смачивания. Смыв проводят путем встряхивания сосуда с пробой на

шуттель-аппарате в течение 20 мин. Смыв фильтруют, центрифугируют, сливают надосадочную

жидкость, ресуспендируют осадок в 0,1 мл физиологического раствора, готовят препарат на

предметном стекле и обрабатывают его, как указано выше.
Обработка результатов анализа. С помощью микрометра измеряют площадь поля зрения
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
микроскопа при выбранном для работы увеличении. При использовании объектива 90 x 1,25 и

окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм.
На каждом мазке под иммерсией просматривают 50 полей зрения, в которых подсчитывают все

споры, имеющие яркое, "полыхающее" зеленое свечение. Вычисляют среднее значение количества

спор в одном поле зрения. Число спор в 1 кг пробы вычисляют по формуле:
                             1000aSV
                         X = -------,
                              V S M
                               1 1
    где:
    a - число спор в одном поле зрения;
    S  - площадь мазка  на предметном стекле, по условиям методики
100 кв. мм;
    S   -  площадь одного поля зрения. При использовании объектива
     1
90 x 1,25 и окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм;
    V  -  разведение,  равно 0,1,  т.к.  осадок  ресуспендируют  в
0,1 мл;
    V   -  объем  суспензии,  нанесенной  на  стекло.  По условиям
     1
методики он равен 0,01 мл;
    M - масса пробы, г;
    1000 - коэффициент для пересчета граммов в кг.
    С учетом значений известных величин формула упрощается:
                                            8
                   100 x 0,1 x 1000 x a   10  x a
               X = -------------------- = -------.
                     0,01 x 0,02 x M       2 x M
Требования безопасности. Соблюдаются общие меры безопасности при работе с химическими
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
реактивами и рекомендуемые для работы с условно-патогенными микроорганизмами:

предупреждение загрязнения проб и соблюдение правил личной гигиены.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Похожие:

Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению дилора в меде методом тонкослойной хроматографии
Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава ссср,...
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению харэлли в воде методом хроматографии в тонком слое
Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава рф,...
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению набу в эфирных маслах методом тонкослойной хроматографии (В дополнение к n 3880-85)
Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава рф,...
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению набу в воде, почве, капусте, сое и зеленых листьях методом
Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава ссср,...
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению аланапа в воде, почве и огурцах методом тонкослойной хроматографии

Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению остаточных количеств омайта в меде методом тонкослойной хроматографии
Разработаны Л. Н. Татишвили, Н. З. Патиашвили нии гигиены труда и профзаболеваний, г
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению дроппа в семенах хлопчатника и винограде методом тонкослойной хроматографии
Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения в хроматографической пробе 0,03
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам Методические указания
Центральным научно-исследовательский институтом эпидемиологии
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению тяжелых металлов в почвах сельхозугодий и продукции
Методические указания предназначены для использования в работе проектно-изыскательских
Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом iconМетодические указания по определению диквата в воде, молоке фотометрическим методом
Краткая характеристика препарата дана в Методических указаниях. Дсд 0,008 мг/кг. В молоке
Разместите кнопку на своём сайте:
ru.convdocs.org


База данных защищена авторским правом ©ru.convdocs.org 2016
обратиться к администрации
ru.convdocs.org