Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств



Скачать 171.24 Kb.
Дата26.07.2014
Размер171.24 Kb.
ТипМетодические рекомендации
Утверждаю
Заместитель главного
государственного врача БССР
В.Г.ЖУКОВСКИЙ
20 мая 1991 г. N 4-18/1890
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ,

ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ

ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Разработаны Институтом питания АМН СССР, кафедрой общей гигиены Белорусского

Государственного института усовершенствования врачей Минздрава СССР.


Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах

санитарно-эпидемиологическими станциями, а также заводскими и сельскохозяйственными

лабораториями.
Введение
Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты,

важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются

остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и

птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов и т.п. Номенклатура лекарств,

используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется.
К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и

животноводстве, относятся антибиотики. Известно большое число антибиотиков, природных и

полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия,

распределением в организме животного, характером метаболизма и др.


Широкое применение антибиотиков в ветеринарии и животноводстве создает определенные

проблемы с точки зрения гигиены питания, требует проведения соответствующих мероприятий для

снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за

остаточными количествами препаратов в продуктах животноводства.


При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать

различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, подавлять активность

некоторых ферментов, изменять микрофлору, способствовать распространению устойчивых форм

микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в

сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
мяса, рыбы, молока и других продуктов, кроме того, наличие антибиотиков может затруднять

бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.


В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйце, рыбе, меде и других продуктах

довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков, что предопределяет

необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля.

Некоторые из перечисленных продуктов являются диетическими (молоко, творог, сметана и др.),

поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно важно.
В СССР остаточные количества ряда антибиотиков регламентированы предельно допустимыми

концентрациями (ПДК) <*>. К ним относятся тетрациклины (0,01 ед./г), пенициллины (0,01 ед./г) и

стрептомицин (0,5 ед./г).
--------------------------------
<*> Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного

сырья и пищевых продуктов. М., Издательство стандартов, 1990 г.


Для контроля уровней этих антибиотиков Минздравом СССР утверждены микробиологические

методы определения, которые позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных

веществ на уровне ПДК.
Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) - эффективный синтетический антибиотик

широкого спектра действия, запрещен к использованию в животноводстве и ветеринарии для

лечения скота, птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано

с токсичностью левомицетина, проявляющейся в аллергических реакциях, поражении кроветворных

органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная

активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.


Микробиологические методы неэффективны для анализа этого антибиотика в пищевых

продуктах, т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять контроль

за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других антибиотиков,

разрешенных к применению.


В связи с этим за рубежом наиболее часто применяют химические методы определения

левомицетина в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.


В настоящих Методических рекомендациях впервые в СССР предпринята попытка применения

для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах простого химического

метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем,

концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных

веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-

деметиламинобензальдегидом.


Доступность реактивов и оборудования позволяет рекомендовать этот метод для серийных

анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных

лабораторий.
Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5 - 10 нг в зоне.

Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при

спектрофотометрическом - 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании

его 0,05 мг/кг продукта и выше.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Метод состоит из следующих основных стадий:
1. Отбор и подготовка пробы.
2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрированного экстракта.
3. Хроматографическое разделение, идентификация и ориентировочная оценка концентрации

левомицетина в экстракте.


4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе.
5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте.
Аппаратура, материалы и реактивы
Гомогенизатор тканей по <...>
Спектрофотометр СФ-26 или аналог
Термостат ТС-80М-2 или аналог
Азот, поверочный нулевой газ
Центрифуга настольная по <...> 375-4261 или аналог
Ротационный испаритель с крышкой по ТУ 25-11-917
Баня масляная или глицериновая
Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой, например стеклянный

четырехгранный сосуд 195 x 195 x 200 мм завода "Дружная горка".


Пластины для тонкослойной хроматографии "Силуфол" размером 15 x 15 см, ЧСФР или

Сорбфил 100 x 100 (г. Краснодар) ТУ 26-11-17-89


Ножницы
Весы технические по ГОСТ 24104
Весы аналитические по ГОСТ 24104
Линейка
Карандаш графитовый М или аналог
Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 мл по ГОСТ 1770
Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл с НШ N 14,5 по ТУ 48-52
Колбы мерные на 25 мл по ГОСТ 1770
Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292
Колбы для упаривания на <...> мл с НШ N 14,5 по ГОСТ 10394
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Микрошприц на 10 и 25 мкл
Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166
Серная кислота по ГОСТ 14262 <...> 1 н
Этилацетат по ГОСТ <...>
Натрий хлористый по ГОСТ <...> насыщенный раствор в воде
Натрий углекислый по ГОСТ <...> 2% водный раствор
Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87
Петролейный эфир, фракции <...>
Метанол
бета-глукуронидаза, водный раствор 1 мг/мл
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Кислота соляная, конц. по ГОСТ 3118
    Хлорид  олова  (II), восстанавливающий реактив: 3 мл 15% раствора

SnCl
                                                                         

2
(в воде) + 15 мл HCl      + 180 мл H O
                    конц.           2
Левомицетин
Однозамещенный фосфат калия
Двузамещенный фосфат натрия
1. Отбор и подготовка проб
Способ отбора и подготовки проб должен быть указан в нормативно-технической

документации на конкретную продукцию.


2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов
и концентрирование экстракта
    Мясо  <*>.  10  +/-  0,1  г  гомогенизируют  с 15 мл 0,025 М
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
фосфатного
буфера,  pH  6,88  (0,34  г  KH PO   и  0,36  г Na HPO  растворяют в

100 мл
                               2  4               2   4


дистиллированной    воды),    добавляли    200    мкл    водного  

раствора
бета-глукуронидазы   и   инкубировали   1,5   часа  при  37  °С. 

Гомогенат
экстрагировали  3  x  30  мл  этилацетата,  при  необходимости

применяя для


расслоения  суспензии  центрифугирование  5  -  10  мин.  при 4000

об./мин.
Этилацетатный слой объединяли.


    --------------------------------
    <*>  Аналогично  извлекали  левомицетин  из мясных продуктов,

органов и


тканей животных.
    Молоко  <**>.  25  +/-  0,1  мл  насыщают  10 г Na SO , приливают

10 мл
                                                      2  4


этилацетата  и  5  мл  1  н   H SO ,  интенсивно встряхивают 1 - 2

мин. Для
                               2  4


расслоения  эмульсии  применяют  центрифугирование  5  -  10  мин.

при 4000
об./мин. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют

последовательно
30  и  20  мл этилацетата, при необходимости применяя

центрифугирование для


расслоения.
    --------------------------------
    <**> Аналогично извлекали левомицетин из кефира, ряженки,

йогуртов.


    Яйцо  <***>.  10  +/-  0,1  г  гомогената яйца перетирают с 5 г

Na SO ,
                                                                     


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
2  4
приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н H SO , перемешивают и

центрифугируют


                                        2  4
5  -  10  мин.  при  4000 об./мин. Этилацетатный слой декантируют, а

водную
часть   экстрагируют   последовательно   30   и   20  мл 

этилацетата,  при
необходимости   применяя  центрифугирование  для  расслоения. 

Объединенные


этилацетатные  экстракты  из  продуктов  промывают последовательно 10

мл 2%
раствора Na CO , насыщенного NaCl, и 10 мл насыщенного раствора NaCl.


           2  3
    ----------------------------
    <***>  Яичный  порошок  предварительно  разводят  водой до

консистенции


жидкой сметаны.
    Органический  слой  отбирают  и упаривают на ротационном

испарителе при


температуре   <=   50   °С  до  минимального  объема,  отдувают 

азотом  до


исчезновения  запаха  этилацетата,  добавляют 3 мл смеси ацетонитрил

- вода
1:4   и  экстрагируют  3  x  5  мл  петролейного  эфира. 

Петролейный  эфир
отбрасывают  и извлекают левомицетин этилацетатом (3 x 5 мл).

Этилацетатный


экстракт  сушат  над  Na SO  (1 г), декантируют, промывают 3 мл

этилацетата


                        2  4
сульфат  натрия,  объединяют  его с экстрактом и  упаривают  на

ротационном


испарителе  при  температуре  <= 50 °С досуха. Остаток растворяют в

200 мкл
метанола.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
3. Хроматографическое разделение,
идентификация и ориентировочная оценка концентрации
левомицетина в экстракте
3.1. Приготовление стандартных растворов
Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в метаноле,

концентрация левомицетина - 1 мг/мл. 0,25 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на

25 мл и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.
При анализе сметаны ее разбавляют в 2,5 - 5 раз в зависимости от жирности. Сыры и творог

гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы.


3.2. Хроматографическое разделение
На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят (рис. а - рисунки здесь и далее не

приводятся): в точки 1, 3 и 5 соответственно 1, 2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4

соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.
    Пластинку  помещают  в  камеру  для  ТСХ  и  хроматографируют в

системе
растворителей  хлороформ  -  метанол  10:1.  По достижении фронтом 

элюента
верхнего  края пластинки ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором 

SnCl  в
                                                                       

2
HCl,     оставляют     на     15     мин.     и    опрыскивают   

раствором


n-диметиламинобензальдегида.  Появление  желтых пятен на

хроматографической


пластинке    по   оттенку   и   R ,  соответствующих   пятнам   

стандарта,


                                 f
свидетельствует  о возможном присутствии левомицетина в продукте.

Сравнивая


интенсивность  окраски  пятен  стандартов  и  опытной пробы,

ориентировочно


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
оценивают содержание левомицетина в экстракте.
               4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе
    Аликвотную  часть  экстракта (50 - 100 мкл) упаривают досуха,

добавляют


150  мкл  10%  раствора HCl, греют на масляной бане при температуре

98 °С в
течение 30 мин., отдувают досуха азотом и приливают 200 мкл 2%

метанольного
раствора N CO .
          2  3
    На  хроматографическую  пластинку наносят 5 - 10 мкл полученной

пробы и
соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом

предварительной
оценки  содержания  левомицетина  в экстракте); пластинку помещают в

камеру
для  ТСХ  и  хроматографируют в системе растворителей хлороформ -

метанол -
уксусная кислота - вода 12:5:4:2.
    По  достижении  фронтом  элюента  верхнего края пластинки ее 

вынимают,


сушат,  опрыскивают  раствором  SnCl   в  HCl,  оставляют  на 15 мин.

Вновь
                                    2


опрыскивают  раствором  n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых

пятен
на  хроматографической  пластинке  по  оттенку и R , соответствующих

пятнам
                                                  f
стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.
                  5. Количественное определение и расчет
                    содержания левомицетина в продукте
    При  необходимости  точного  количественного определения
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
левомицетина в
пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько

точек,
близко  расположенных  друг  к другу, аликвотную часть экстракта и

таким же
образом  раствор  стандарта  так,  чтобы количество левомицетина в

нем было
близко  к  установленному  в  пробе  при ориентировочной визуальной

оценке.
Пластинку  хроматографируют  и  опрыскивают  как  в  п.  3.2.

Вырезают зоны


левомицетина  в  опытной пробе, стандарте и соответствующую по R  и

площади
                                                                f


зону  на  пластинке,  служащую  контролем  (рис. б). Зоны элюируют 3

x 1 мл
метанола,  метанол  упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора

SnCl  в
                                                                       

2
5% HCl, греют при температуре 98 °С в  течение  1  часа;  пробы 

охлаждают,
добавляют  по 2 мл 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в

метаноле, 1 мл


метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной

пробы
и  стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в

кюветах с
l = 10 мм при лямбда = 430 нм.
    Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:
                                 ОП  x P x V
                       -3          о
                 C = 10   x k x ------------- (мг/кг),
                                ОП   x V  x M
                                  ст    1
    где:
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
    k - коэффициент,   учитывающий   полноту   извлечения  

левомицетина из


пищевого  продукта  и равный 1,33 для мяса, 1,13 - для молока и 1,25

-  для
яиц;


    ОП   - оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.;
      о
    ОП   - оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.;
      ст
    P - количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку,

мкг;
    V - объем анализируемой пробы, мкл;


    V  - объем  аликвотной  части  экстракта,  взятой  для 

количественного
     1
определения, мкл;
    M - масса образца пищевого продукта, кг (л).
Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5 - 6,0 мкг.
Вычисления проводят до второго десятичного знака.
За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных

определений, расхождение между которыми не превышает 20%.


Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.
Заключение
В случае обнаружения остаточных количеств левомицетина и подтверждения правильности его

идентификации в исследуемых пищевых продуктах вопрос с их реализацией решается согласно

"Методическим указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах

животноводства". Москва, Минздрав СССР, ГОЭУ. 1985 г., 34 с. <*>


--------------------------------
<*> N 3049-84 от 29 июня 1984 г.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
РЕЦЕНЗИЯ
НА МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ,
ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ
ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Представленные рекомендации являются первой в СССР попыткой наладить систематический

контроль за наличием и уровнями левомицетина в пищевых продуктах. До настоящего времени

анализ левомицетина при необходимости выполняли микробиологически. Однако, отсутствие

чувствительных тест-культур не позволяет рассчитывать на обнаружение микрограммовых количеств

этого антибиотика такими способами. В связи с этим особенно важно создание химического метода

контроля остаточных количеств левомицетина, позволяющего с небольшими затратами обнаружить,

идентифицировать и количественно определить его содержание. Левомицетин обладает

определенной токсичностью и поэтому запрещен к использованию как у нас в стране, так и за

рубежом для лечения, например, лактирующих коров или кур-несушек. Анализ литературных данных

позволяет сделать заключение, что применение его для лечения сельскохозяйственных животных и

птицы - достаточно частое явление, оправданное дешевизной и эффективностью препарата.
Интенсификация сельскохозяйственного производства может стать одной из причин снижения

качества пищевых продуктов и, в частности, загрязнения их антибиотиками. Поэтому своевременный

и надежный контроль за наличием левомицетина становится важным и актуальным.
Все отмеченное позволяет рекомендовать утвердить разработанные методические

рекомендации для внедрения в практику работы учреждений Госсаннадзора. Полученные этим

методом материалы целесообразно обобщить для создания общей картины частоты и уровней

загрязнения пищевых продуктов БССР левомицетином.


Руководитель отдела гигиены питания
Института питания АМН СССР, профессор
Г.И.БОНДАРЕВ
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Похожие:

Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств омайта в меде методом тонкослойной хроматографии
Разработаны Л. Н. Татишвили, Н. З. Патиашвили нии гигиены труда и профзаболеваний, г
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств n-окиси-2,6-лутидина в воде, почве, зеленой
Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава рф,...
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств пирипроксифена в зеленой массе, огурцах и
Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания т-2 токсина в пищевых продуктах
Хроматограф газовый серии "Цвет-100" с детектором постоянной скорости рекомбинации
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств пиклорама в воде, почве, зерне и растительном
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств биопрепарата вирин-экс на растительных
...
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств бромуконазола в воде, почве, зерне и зеленой
Эрисмана (академик рамн, проф. В. Н. Ракитский, проф. Т. В. Юдина), Российским государственным
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств тритосульфурона в воде, почве, зерне и соломе
Эрисмана (академик рамн, проф. В. Н. Ракитский, проф. Т. В. Юдина), Российским государственным
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению остаточных количеств метсульфурон-метила в воде, почве, зерне и
Эрисмана (академик рамн, проф. В. Н. Ракитский, проф. Т. В. Юдина) при участии Департамента
Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств iconМетодические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом
Принцип метода. В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях
Разместите кнопку на своём сайте:
ru.convdocs.org


База данных защищена авторским правом ©ru.convdocs.org 2016
обратиться к администрации
ru.convdocs.org